- International Journal of Advances in Engineering and Pure Sciences
- Vol: 33 Issue: 4
- High-Level Production of MMLV Reverse Transcriptase Enzyme in Escherichia Coli
High-Level Production of MMLV Reverse Transcriptase Enzyme in Escherichia Coli
Authors : Özlem Kaplan, Rizvan Imamoğlu, Isa Gökçe
Pages : 549-555
Doi:10.7240/jeps.877806
View : 14 | Download : 3
Publication Date : 2021-12-30
Article Type : Research
Abstract :Moloney murin lösemi virüs (MMLV) ters transkriptazı (RT), cDNA sentezi ve RNA amplifikasyonu için en yaygın kullanılan enzimdir. Bu çalışmada moleküler çalışmalardaki önemi nedeniyle MMLV RT enziminin rekombinant olarak üretilmesi amaçlanmıştır. Bu bağlamda, MMLV RT enzimini kodlayan DNA fragmanı pTOLT plazmidine klonlanmış ve E. coli BL21 (DE3) pLysE hücrelerinde eksprese edilmiştir. Proteinin yüksek düzeyde ekspresyonu, protein moleküllerinin inklüzyon cisimciklerinde toplanmasına neden olduğundan MMLV RT proteininin çözünür formda elde edilebilmesi için MMLV RT ve şaperon plazmidlerin (pG-KJE8, pGro7, pKJE7, pGTf2, pTf16) birlikte ekspresyonu gerçekleştirilmiştir. Beklentilerimizin aksine, protein çözünür formda elde edilemediği için, yeniden katlama prosesi kullanılarak inklüzyon cisimciklerinden geri kazanılmıştır. Son olarak protein, afinite kromatografisiyle saflaştırılmış ve proteinin aktivitesi RT-PCR tekniği kullanılarak kontrol edilmiştir.Keywords : İnklüzyon cisimcikleri, Moloney murin lösemi virüsü, Ters transkriptaz, cDNA sentezi