- Anadolu Kliniği Tıp Bilimleri Dergisi
- Vol: 24 Issue: 1
- Allele-specific Emulsion PCR (asePCR) as a Liquid Biopsy Method for Residual Tumor Detection
Allele-specific Emulsion PCR (asePCR) as a Liquid Biopsy Method for Residual Tumor Detection
Authors : Bedri KARAKAS
Pages : 47-52
Doi:10.21673/anadoluklin.441594
View : 10 | Download : 3
Publication Date : 2019-01-30
Article Type : Research
Abstract :Amaç Bu çalışmada kanser hastalarının kan plazmasında sirkülasyondaki hücresiz tümör DNA’sının (ctDNA) saptanışına yönelik alel-spesifik bir emülsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (asePCR) tekniği geliştirmek amaçlanmıştır. Gereç ve Yöntemler Normal tip DNA ile mutant DNA’nın spesifik seyreltisini (spike-in) elde etmek için, normal (doğal tip) ve tiroit kanserli (mutant) hücre hatlarından (MCF10A ve B-CPAP) ekstrakte edilen iki tip genomik DNA kullanıldı. asePCR tekniğimizi doğrulamak için BRAFV600E hotspot mutasyonu hedeflendi. İki sıralı PCR adımı (düzenli ve asePCR), normal DNA içindeki mutant DNA fraksiyonunu tespit etmek için her bir adım için özel olarak tasarlanmış primerler ile gerçekleştirildi. Düzenli PCR ile çoğaltılan DNA örnekleri, asePCR’de spesifik olarak tasarlanmış mutant ve normal tip alel-spesifik primerler ve ortak primer ile kovalent olarak bağlanmış olan tanecikler ile birlikte kullanılmıştır. asePCR reaksiyon karışımı, mineral yağ içinde su emülsiyon bölmelerinde kapsüllendi ve spesifik PCR program ayarları ile bir termosistörde inkübe edildi. asePCR reaksiyonunun sonunda, mineral yağ bölmeleri kırıldı ve DNA kaplı taneler FACS ile değerlendirildi ve her örnek için mutant ve normal tip fraksiyonları sayıldı. Bulgular AsePCR tekniği, prensip kanıtı olarak normal tip DNA’nın (%0 mutant) arka planında mutant DNA’yı başarıyla tespit etti. Bilinen mutant fraksiyonu ile asePCR ile ölçülen fraksiyon arasında güçlü bir korelasyon (r2>0,99) bulundu. AsePCR, normal tipteki örnekte hiçbir yanlış pozitiflik tespit etmediği gibi normal tip örnekteki DNA’nın arka planındaki çeşitli düşük mutant DNA fraksiyonlarını da tutarlı bir şekilde tespit edecek kadar hassas ve spesifikti. Tartışma ve Sonuç asePCR tekniğimiz, tümör yanıtını değerlendirmeye ve olası relapsları erken teşhise yönelik bir sıvı biyopsi yöntemi olarak, kanser hastalarının plazmasında mutant ctDNA tespiti için kullanılabilir.Keywords : ctDNA, cfDNA, dijital PCR, emülsiyon-PCR, kanser, sıvı biyopsi